Mesure de la capacité antioxydante

Méthode ORAC

Le test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) a été développé par Pryor et Cao aux Etats-Unis, avec l’agrément du Service de Recherche de l’Agriculture dans le but d’évaluer la capacité antioxydante globale que représentent 100 grammes de divers fruits et légumes (J Agric Food Chem 50 :3122-3128, 2002). Mais récemment, les valeurs ORAC d’aliments sélectionnés ont été supprimées de la base de données du site "USDA’s Nutrient Data Laboratory  (NDL)" en raison du manque de relevance des données ORAC et des effets de composés bioactifs spécifiques, comme les polyphénols sur la santé humaine.

Principe:

Cette méthode mesure la dégradation de la fluorescéine (FL: 3′,6′-dihydroxyspiro[isobenzofuran-1[3H],9′[9H]-3-one]) induite par la décomposition thermique (37°C) de l’AAPH (2,2′-azobis (2 amidinopropane) dihydrochloride) en deux radicaux libres. La présence d’antioxydants dans l’échantillon en retarde la dégradation. La réaction est standardisée par rapport à des concentrations connues de Trolox connu pour son activité antioxydante.

Méthode DPPH

Cette analyse simple dans son application est en tout point complémentaire au test ORAC. La capacité antioxydante déterminée par cette méthode est bien corrélée au contenu en polyphénols totaux présents dans l’aliment étudié (Int J Food Sci Nutr 56 :473-481, 2005 ; J Agric Food Chem 54 :607-616, 2006). Nous avons utilisé cette méthode avec succès pour évaluer l’activité antioxydante contenue dans les feuilles, les bourgeons et les fruits de cassis (J Food Agr Chem 54: 6231-6236, 2006).

Principe:

Le radical DPPH^·+ (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) est stable à température ordinaire et présente une couleur bleue bien caractéristique. Les antioxydants présents dans l’échantillon le réduisent entraînant une décoloration facilement mesurable par spectrophotométrie à 517 nm.. La méthode est généralement standardisée par rapport au Trolox.

Méthode ABTS ou TEAC

Comme le test au DPPH, cette analyse simple dans son application est en tout point complémentaire au test ORAC. Elle apparaît toutefois moins sensible que les tests ORAC et DPPH.

Principe:

En réagissant avec le persulfate de potassium (K₂S₂O₈), l’ABTS (acide 2,2′-azino-bis(3éthylbenz-thiazoline-6-sulfonique)) forme le radical ABTS^.+, de couleur bleue à verte. L’ajout d’antioxydants va réduire ce radical et provoquer la décoloration du mélange. La décoloration du radical mesurée par spectrophotométrie à 734 nm est proportionnelle à la concentration en antioxydants. La méthode est généralement standardisée par rapport au Trolox.

Méthode FRAP

Cette méthode est en tout point complémentaire aux autres tests comme l’ORAC, le TEAC ou le test DPPH.

Principe:

Les antioxydants sont déterminés par colorimétrie. Le complexe ferrique-tripyridyltriazine est réduit en la forme ferreux-tripyridyltriazine en présence d’antioxydants; le complexe perd sa couleur jaune pour un bleu foncé. Cette coloration mesurée à 595 nm est proportionelle à la concentration en antioxydants présents dans les échantillons. La méthode est  standardisée par rapport au Trolox.

Test d’hémolyse des globules rouges

(en collaboration avec la plateforme hospitalo-universitaire NAS)

Cette méthode a l’avantage de se rapprocher très fort des conditions physiologiques. Elle a été utilisée avec succès par notre laboratoire pour la démonstration de l’action antioxydante des polyphénols (Life Sci 78: 2488-2493, 2006) ou de boissons contenant ces molécules (Int J Food Sci Nutr 56: 551-559, 2005).

Principe:

Du sang prélevé sur EDTA est centrifugé à 3000 t/min pendant 10 minutes et le culot de globules rouges résultant est lavé avec du liquide physiologique (NaCl 0,9%). Le culot de globules est ensuite mis en contact à 37 °C avec du AAPH (2,2’-azobis (2 amidinopropane) dihydrochloride). La décomposition thermique de ce composé génère des radicaux libres à vitesse constante qui attaquent la membrane des globules rouges (Int J Vitam Nutr Res 75: 11-18, 2005). Lorsque les antioxydants endogènes sont consommés, la membrane des globules rouges éclate et de l’hémoglobine se retrouve dans le surnageant. Le suivi de l’hémolyse se fait par spectrophotométrie à 545 nm. L’ajout dans le milieu d’incubation de molécules ou d’extraits à activité antioxydante retarde l’apparition de l’hémolyse.  La méthode est standardisée par rapport à l’Acide Ascorbique.